Identificación de especies de Leishmania mediante PCR en tiempo real acoplada a curvas de fusión de alta resolución

RESUMEN Introducción: La leishmaniasis es una enfermedad causada por parásitos del género Leishmania. En Colombia se han informado 10 especies patógenas. El diagnóstico parasitológico tradicional basado en la observación de los parásitos no permite identificar la especie, por lo cual se deben emplear métodos moleculares, entre ellos la reacción en cadena de la polimerasa o PCR convencional, pero esta presenta algunas limitaciones y requiere extensos periodos de tiempo para la obtención de resultados, que en ocasiones no son concluyentes. Objetivo: Evaluar un método basado en PCR en tiempo real acoplado a curva de temperatura de desnaturalización media de alta resolución (PCR-HRM) que permita el diagnóstico y la identificación simultánea de parásitos del género Leishmania en muestras clínicas de humanos y en cultivos in vitro de manera sensible y específica. Métodos: Se estandarizó una PCR-HRM, mediante la cual se evaluaron 237 muestras clínicas, 98 clasificadas como positivas y 139 como negativas, parasitológicamente por directo y/o cultivo. Las tipificaciones fueron comparadas con los resultados en paralelo obtenidos de una variante de la PCR, realizando cortes al amplicon que generó un fragmento de restricción de longitud polimórfica o PCR-RFLP que había sido previamente estandarizada. Resultados: Se logró implementar una PCR-HRM para el diagnóstico e identificación de especies de Leishmania, logrando un 100 % de concordancia con las tipificaciones obtenidas por PCR-RFLP. Incluso, se logró detectar e identificar el parásito en muestras diagnosticadas como negativas por los métodos convencionales. Se encontró que con un porcentaje de confiabilidad superior al 95 %, se lograron tipificar 91 muestras de 98; de estas el 81,63 % de los casos fueron L. panamensis, el 11,22% L. braziliensis e indeterminadas el 7,14 % de los casos. Conclusiones: La PCR-HRM es un buen método que permite la identificación de las especies más prevalentes en Colombia, comparando temperaturas medias de desnaturalización específicas según la especie de Leishmania involucrada.

ABSTRACT Introduction: Leishmaniasis is a disease caused by parasites of the genus Leishmania. Ten pathogenic species have been reported in Colombia. Traditional parasite diagnosis based on observation of the parasites does not make it possible to identify the species. Therefore, it is necessary to use molecular methods, among them conventional polymerase chain reaction or PCR, but this test presents some limitations and requires long periods of time to obtain results which sometimes are not conclusive. Objective: Evaluate a method based on real time PCR coupled with high resolution mean denaturalization temperature curve analysis (HRM-PCR) for the diagnosis and simultaneous identification of parasites of the genus Leishmania in clinical samples from humans and in vitro cultures in a sensitive and specific manner. Methods: Standardization was performed of an HRM-PCR with which 237 clinical samples were evaluated, 98 classified as positive and 139 as negative, by direct parasitological examination and/or culture. The typing obtained was compared with parallel results from a PCR variant, making cuts on the amplicon that generated a restriction fragment length polymorphism or PCR-RFLP previously standardized. Results: An HRM-PCR could be implemented for the diagnosis and identification of Leishmania species, achieving 100% concordance with the typing obtained by PCR-RFLP. It was even possible to detect and identify the parasite in samples diagnosed as negative by conventional methods. Of the total 98 samples, 91 could be typed with a percentage of reliability above 95%. Of these, 81.63% of the cases were L. panamensis, 11.22% were L. braziliensis and 7.14 % were indeterminate. Conclusions: HRM-PCR is a good method to identify the species most prevalent in Colombia, comparing specific mean denaturalization temperatures according to the Leishmania species involved.

Flebotominos adultos e inmaduros (Diptera: Psychodidae): registros para el Caribe colombiano / Adult and immature phlebotomine sandflies (Diptera: Psychodidae): records for the Caribbean región of Colombia

Elaborar inventarios de lutzomyia spp., sin considerar los estados inmaduros de dichos insectos, provee información parcial. Investigar los estados inmaduros de lutzomyia, es un reto y necesidad actual especialmente en áreas con transmisión de leishmania spp. El objetivo de este estudio fue detectar sitios de cría naturales, para un inventario de flebotominos adultos e inmaduros del municipio de Colosó (Sucre, Colombia). Los flebotominos fueron recolectados entre mayo y diciembre de 2009, en la estación experimental de fauna silvestre de Colosó. La detección de estados inmaduros se desarrolló por revisión directa de muestras de suelo y árboles, incubación de estos sustratos en laboratorio y por trampas de emergencia. La colecta de adultos se realizó por búsqueda activa diurna con aspiradores bucales en sitios de reposo, principalmente en bases, huecos y raíces tabulares de árboles. Se aislaron 44 inmaduros de flebotominos, de los cuales 32 correspondieron a las especies lutzomyia migonei, Lu. dubitans, Lu. serrana, Lu. cayennensis cayennensis, Lu. micropyga, Lu. evansi, Lu. gorbitzi, Lu. ovallesi y Lu. shannoni. Así mismo, se colectaron 1231 ejemplares adultos entre los cuales Lu. evansi, Lu. micropyga y Lu. trinidadensis fueron, en su orden, las especies más abundantes. Lu. migonei y Lu. gorbitzi constituyen, respectivamente, primeros registros para el departamento de Sucre y la Costa Caribe. Es necesario incluir muestreos de insectos inmaduros como información complementaria en estudios sobre flebotominos y así reunir información sólida para elaborar inventarios de especies señalando los potenciales vectores en focos de leishmaniasis.

Elaborating an inventory for Lutzomyia spp., without considering the immature forms of such insects, gives only a partial information about the species. Investigating immature phlebotomines represents a challenge and urgency especially in Leishmania spp. transmission areas. The objective of this study was to detect natural breeding sites, for an inventory of immature and adult phlebotomine community in the municipality of Colosó, Department of Sucre. Phlebotomine sandflies were collected between May and December of 2009, at the wild life experimental station in Colosó. Detection of immature stages was approached by direct visualization of soil and tree-substrate samples, incubation of substrate in laboratory conditions and use of emergence traps. Adult sampling was conducted by active diurnal search in resting places using bucal aspirators to collect the insects. Resting places were predominantly associated with tree trunks, such as holes in trunks and buttress roots. We collected 44 immatures of phlebotomine sandflies of which 32 belong to the following species: Lutzomyia migonei, Lu. dubitans, Lu. serrana, Lu. cayennensis cayennensis, Lu. micropyga, Lu. evansi, Lu. gorbitzi, Lu. ovallesi and Lu. shannoni. Also, up to 1231 adult individuals were collected and the most abundant species in descending order were Lu. evansi, Lu. micropyga and Lu. trinidadensis. The species Lu. migonei and Lu. gorbitzi are worth noticing given the fact that they represent new records for the Department of Sucre as well as the Caribbean Region in the country. It is necessary to include immature sampling as complementary information on phlebotomine surveys and in this way gather solid information to release proper species inventories with the remarks on potential vectors in leishmaniasis foci.